摘要：試驗(yàn)旨在克隆并構(gòu)建水牛miR-302s慢病毒真核表達(dá)載體(bbu-miR-302s),對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并嘗試將該載體應(yīng)用于水牛體細(xì)胞重編程中。以水牛基因組DNA為模板擴(kuò)增得到bbu-miR-302s前體序列,測(cè)序正確后將其連入pLVX-IRES-ZsGreen1構(gòu)建重組慢病毒真核表達(dá)載體。重組的慢病毒真核表達(dá)載體經(jīng)過酶切鑒定正確后,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法包裝慢病毒顆粒,通過感染HEK-293T細(xì)胞及豬和水牛體細(xì)胞,檢測(cè)重組慢病毒載體的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFF)后,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),檢測(cè)能否產(chǎn)生水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。采用CoGeMiR數(shù)據(jù)庫查詢法和SnapGene Viewer軟件進(jìn)行miR-302s家族在基因組中的定位分析;利用ClustalX 1.83軟件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk軟件預(yù)測(cè)bbu-miR-302s主要的靶基因,并運(yùn)用DAVID程序?qū)Π谢蜻M(jìn)行信號(hào)通路富集。測(cè)序結(jié)果顯示,擴(kuò)增獲得的序列是水牛miR-302s家族,包裝的重組慢病毒滴度為7.2×10 6 TU/mL,并可以有效感染3個(gè)物種的體細(xì)胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,細(xì)胞經(jīng)歷形態(tài)變化并發(fā)生聚集形成克隆樣,堿性磷酸酶檢測(cè)陽性,但多能基因及表面抗原檢測(cè)結(jié)果均為陰性,說明單因子miR-302s不足以完全重編程BFF為水牛iPSC,但促進(jìn)了重編程進(jìn)程。CoGeMiR數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),miR-302s家族主要位于LARP 7基因的內(nèi)含子區(qū);SnapGene Viewer軟件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),bbu-miR-302s位于水牛7號(hào)染色體LARP 7基因的內(nèi)含子區(qū)。序列同源性分析表明,miR-302s家族成員間及miR-302s簇成員在不同物種間均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255個(gè),這些靶基因主要集中在33個(gè)信號(hào)通路中,其中PGK信號(hào)通路與胰高血糖素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控干細(xì)胞信號(hào)通路最為顯著。本研究結(jié)果為后續(xù)開展miR-302s簇在體細(xì)胞重編程中的作用奠定基礎(chǔ)。